Vysoká kvalita

Nejvyšší dosažitelná kvalita

Zajišťujeme pečlivou výstupní kontrolu každé šarže nezávislou na výrobě. Produkty jsou vybaveny certifikáty kvality, které jsou dostupné v elektronické formě. Všechny výrobky...

Čtěte víc

Certifikace ISO PDF

Jsme držitel certifikátu ISO 9001:2015 Výroba vysoce kvalitních činidel...

Čtěte víc

Firemní desatero

  • Výroba reagens nejvyšší dosažitelné kvality
  • Náročná výstupní kontrola
  • Důraz na inovace...

Čtěte víc

Novinky

Q-Taq DNA polymeráza

Carrier-iRNA + Carrier-ACRYL + Carrier-GLY

Economy DNA marker 100-500

RNA CT Protector 

DNA-free PCR Master Mixy 

Blood Taq DNA polymeráza

Popis

Blood Taq DNA polymeráza je nová geneticky modifikovaná forma teplotně rezistentní DNA polymerázy pro hot start PCR v přítomnosti krevních inhibitorů. Cílené mutace způsobily, že enzym vykazuje zvýšenou odolnost k inhibičnímu působení krevních inhibitorů, interkalačním DNA barvivům a některým dalším inhibitorům PCR. Enzym je funkční v přítomnosti až 20% neseparované krve. Při této koncentraci krve jsou jiné komerčně dostupné enzymy nefunkční. Rezistence ke krevním inhibitorům a zvýšené teplotě umožňuje provádět amplifikace krevních vzorků bez nutnosti izolace DNA. Tato vlastnost zásadním způsobem zjednodušuje provedení PCR. Hot start PCR je zajištěna přítomností DNA aptameru, který se váže na Blood Taq DNA polymerázu a redukuje produkci nespecifických fragmentů DNA.

Blood Taq DNA polymeráza

Tato mutantní forma Taq DNA polymerázy katalyzuje syntézu komplementárního řetězce DNA ve směru 5´→3´, ale na rozdíl od Taq DNA polymerázy nevykazuje 5´→3´ exonukleázovou aktivitu. Cílené mutace vedly k zvýšené aktivitě a vysoké toleranci enzymu k různým inhibitorům. Hlavní využití enzymu je v rutinní diagnostické analýze DNA fragmentů o velikosti do 5000 párů bází z různých zdrojů, zvláště při použití celé krve (bez izolace DNA) a jiných obtížně amplifikovatelných vzorků.

Hot Start

Tento produkt obsahuje DNA aptamer, který se specificky a reverzibilně váže na Blood Taq DNA polymerázu a tím blokuje její enzymatickou aktivitu. Při teplotě nad 50°C dochází k uvolnění aptameru a tím k odblokování enzymatické aktivity polymerázy. Tímto způsobem výrazně klesá tvorba nespecifických DNA fragmentů při PCR. Ve srovnání s anti-Taq monoklonální protilátkou, která se často používá pro hot start PCR, použitý aptamer má několik výhod:

    • (1) není denaturován při teplotách až do 100°C,
    • (2) má relativně nízkou molekulovou hmotnost,
    • (3), má známé a definované složení,
    • (4) je připravován synteticky,
    • (5) není kontaminován komponentami savčích buněk,
    • (6) je odolný k působení proteáz a tím umožňuje přepravu enzymu a přípravu PCR bez chlazení a
    • (7) je cenově dostupnější.

Technické údaje

Komponenty a balení

  • Blood Taq DNA polymeráza je dodávána v koncentraci 1 U/µl. V základním balení je 1 zkumavka obsahující 500 U/500 µl (kat. č. B222), 5 zkumavek po 500 U/500 µl (kat. č. B223) nebo 10 zkumavek po 500 U/500 µl (kat. č. B224).
  • Ke každé zkumavce s Blood Taq DNA polymerázou je dodávána zkumavka (1,5 ml) s 10x reakčním pufrem (PCR Blue buffer) s 25 mM MgCl2. Při požadavku na odlišnou koncentraci MgCl2 je možné objednat 10x PCR Blue Buffer bez MgCl2, ke kterému je dodáván 25 mM MgCl2 v samostatné zkumavce (kat. č. T059).

Skladování

  • Skladovat při teplotě -20°C ± 5°C. Krátkodobě (dny) lze skladovat/přepravovat při teplotě až do 30oC.

Složení

  • Skladovací pufr: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 (25°C), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Nonidet P-40, 0,5% Tween 20, 50% glycerol.
  • 10x PCR blue pufr: 750 mM Tris-HCl, pH 8,8 (25°C), 200 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20, 25 mM MgCl2.

Aktivita

  • Jedna jednotka aktivity (U) je definována jako množství enzymu, které katalyzuje zabudování 10 nmol dNTP za 30 min při 72°C do denaturované DNA precipitovatelné trichloroctovou kyselinou. Reakce probíhá v objemu 50 µl v pufru obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 8,8, 25°C), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dATP, 200 µM dCTP, 200 µM dGTP a 200 µM [α-32P]dTTP, 50 µg/ml denaturované DNA, 0,5 µM primeru a 0,2 - 0,5 U enzymu.

Kontrola kvality

  • Čistota Blood Taq DNA polymerázy je ověřována metodou SDS-PAGE. Enzym migruje jako jediný proužek o molekulové hmotnosti přibližně 62 kD. Preparát neobsahuje nukleázy.
  • Každá šarže Blood Taq DNA polymerázy je testována na schopnost amplifikovat fragment genu lidské genomové DNA v celé krvi odebrané do Na-citrátu (finální koncentrace krve v PCR reakční směsi je 10%). Výsledný produkt je analyzován elektroforézou na agarózovém gelu v přítomnosti ethidium bromidu; dominantní je očekávaný fragment DNA (Obr. 1 a 2).

 

blood1

Obr. 1. Amplifikace fragmentu lidského genu CCR5 pomocí PCR s neseparovanou krví odebranou do Na citrátu. Finální koncentrace krve byla 10%, 4%, 2%, 1% nebo 0%. K amplifikaci byla použita Blood Taq DNA polymeráza (Top-bio, kat. č. B222; 2,5 U/50 µl) nebo běžná Taq DNA polymeráza Top-Bio (kat. č. T111; 2,5 U/50 µl). Směs pro PCR obsahovala 1x Blue buffer s 2,5 mM MgCl2 (kat. č. T058), PCR dNTP mix (200 µM každý z nukleotidů; kat. č. P041), 500 nM primery a odpovídající množství krve. Amplifikace probíhala za následujících podmínek: úvodní denaturace (5 min při 95oC), 30 cyklů zahrnujících denaturaci (15 s při 94oC), nasedání primerů (15 s při 55oC) a syntézu DNA (45 s při 72oC). Na závěr byla finální extenze amplikonů (7 min při 72oC). PCR produkty byly smíchány s vkládacím pufrem (Red load, kat. č. P066), analyzovány elektroforézou v 1% agarózovém gelu (kat. č. P045) a vizualizovány barvením pomocí ethidium bromidu (kat.č. P046).
Závěr: Výsledky ukazují, že Blood Taq DNA polymeráza je schopna amplifikovat fragment genomové DNA o velikosti 1135 bp z neseparované krve ve finální koncentraci až 10%. Nemutovaná forma Taq DNA polymerázy je schopna amplifikovat stejný fragment z neseparované krve v koncentraci maximálně 1%; vyšší koncentraci jsou inhibiční.  

 

bloodfig2

Obr. 2. Amplifikace fragmentu lidského genu CCR5 pomocí PCR s neseparovanou krví s různými antikoagulačními látkami. Lidská krev byla odebrána do 3,2% citrátu sodného (BD Vacutainer – Na citrate; 9NC), EDTA (BD Vacutainer – EDTA; K2E) nebo 17 IU lithium heparinu (BD Vacutainer – Li Heparin; LH-BD PSTTM; polymer, gel).  Finální koncentrace krve byla 10%. K amplifikaci byla použita Blood Taq DNA polymeráza (Top-Bio; Kat. č. B222). Složení reakčních směsí, cyklovací podmínky a způsob vyhodnocení tvorby PCR amplikonů je popsán v legendě k Obr. 1.
Závěr: Výsledky ukazují, že Blood Taq DNA polymeráza je schopna amplifikovat fragment genomové DNA o velikosti 1135 bp z 10% krve bez ohledu na použití antikoagulačního agens.

Soubory ke stažení

Kat. č. Název Balení Cena
B222 Blood Taq DNA polymeráza 500 U 1990 Kč
B223 Blood Taq DNA polymeráza 5x 500 U 7960 Kč
B224 Blood Taq DNA polymeráza 10x 500 U 13930 Kč
Ceny jsou bez DPH 21% a zahrnují dopravu po celé České republice.