Aptamer Taq DNA polymeráza

Popis produktu

Aptamer Taq DNA polymeráza je obdobou Combi Taq DNA polymerázy (kat. č. C205-C207) od které se liší tím, že namísto monoklonální protilátky anti-Taq obsahuje DNA aptamer anti-Taq. Tento aptamer, stejně jako protilátka inhibuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy. Ve srovnání s protilátkou má aptamer anti-Taq několik výhod při použití pro „hot-start“ PCR:
(1) nedochází u něj k irreverzibilní denaturaci při teplotách až do 100^oC,
(2) jedná se o nízkomolekulární látku, která je připravována synteticky a má známé a definované složení,
(3) není kontaminován komponentami savčích buněk,
(4) je odolný k působení proteáz a umožňují přípravu PCR směsí při pokojové teplotě,
(5) je cenově dostupnější.

Hot Start

• Tento produkt obsahuje DNA aptamer anti-Taq, který se specificky váže na Taq DNA polymerázu a tím blokuje její enzymatickou aktivitu. Při teplotě nad 50^oC dochází k uvolnění aptameru a tím k odblokování enzymatické aktivity DNA polymerázy. Tímto způsobem výrazně klesá tvorba nespecifických DNA fragmentů v důsledku aktivity polymerázy před prvním cyklem PCR.

Taq DNA polymeráza

• Taq DNA polymeráza je termostabilní enzym pocházející z bakterie Thermus aquaticus. Tento enzym katalyzuje syntézu komplementárního řetězce DNA ve směru 5´→3´ a také vykazuje exonukleázovou aktivitu ve směru 5´→3´. Při amplifikaci DNA fragmentů Taq polymeráza často přidává na 3´ konec přesahující adenosin, který lze využít pro tzv. TA klonaci PCR produktů. Tato polymeráza však nemá exonukleázovou aktivitu ve směru 3´→5´ a v důsledku toho není schopna opravovat chyby vzniklé při amplifikaci. Výhodou tohoto enzymu je jeho vysoká aktivita (amplifikace 1000 párů bází (bp) trvá < 1 minutu); nevýhodou je výskyt chyb při replikaci (přibližně 1 chyba na 10⁵ až 10⁶ syntetizovaných párů bází). Hlavní využití Taq DNA polymerázy je v diagnostické analýze přítomnosti specifických fragmentů DNA pomocí PCR až do velikosti kolem 5000 bp.

Technické údaje

Komponenty a balení

• Aptamer Taq DNA polymeráza je dodávána v koncentraci 1 U/µl. V základním balení jsou 1 zkumavka obsahující 500 U/500 µl (kat. č. A025), 5 zkumavek po 500 U/500 µl (kat. č. A026) nebo 10 zkumavek po 500 U/500 µl (kat. č. A027).
• Ke každé zkumavce s Aptamer Taq DNA polymerázou je přidána 1 zkumavka s 10x konc. reakčním pufrem (10x PCR Blue Buffer complete, 1,5 ml). 

Pro optimalizaci koncentrace MgCl₂ lze objednat 10x konc. PCR Blue Buffer bez MgCl₂ s 25 mM MgCl₂ v samostatné zkumavce (kat. č. T059).

Skladování

• Skladovat při teplotě -20°C ± 5°C. Krátkodobě (dny) lze skladovat/přepravovat při teplotě až do 30^oC.

Složení

• Skladovací pufr pro Aptamer Taq DNA polymerázu: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 (25°C), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Nonidet P-40, 0,5% Tween 20, 50% glycerol.
• 10x PCR Blue Buffer: 750 mM Tris-HCl, pH 8,8 (25°C), 200 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1% Tween 20, 25 mM MgCl₂.

Aktivita

• Jedna jednotka aktivity (U) je definována jako množství enzymu, které katalyzuje zabudování 10 nmol dNTP během 30 min při 72°C do materiálu precipitovatelného trichloroctovou kyselinou. Reakce probíhá v objemu 50 µl v pufru obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 8,8 při 25°C), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂, 200 µM dATP, dCTP, dGTP a [α-³²P]dTTP, 50 µg/ml denaturované DNA, 0,5 µM primer a 0,2 - 0,5 U enzymu.

Kontrola kvality

• Čistota Aptamer Taq DNA polymerázy je ověřována metodou SDS PAGE. Enzym migruje jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kD. Preparát neobsahuje nukleázy.
• Každá šarže Aptamer Taq DNA polymerázy je testována na schopnost amplifikovat fragment genu savčí genomové DNA, izolované pomocí DEP-25 DNA Extraction Kitu (Kat. č. D225 – D227), v PCR. Výsledný produkt je analyzován elektroforézou na agarózovém gelu v přítomnosti ethidium bromidu; pouze očekávaný fragment DNA je produkován.